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Amplifying and Quantifying HIV

时间:2019-02-28 来源:原创 作者:locoy 点击:加载中..
  

  要得到7毫升血浆,旋转条约14毫升的血液收集儿子在15毫升EDTA,15分钟,在2600 XG(肝斋)无制触动收集儿子管。移液器(壹定要备止巴菲涂层)为15毫升管的血浆。 假设RNA是单拷贝检测(SCA),秒杀Rous肉瘤病毒外面部的病毒粒儿子把持(RCAS)30000份血浆中提。 RCAS病毒前预备实行政制事政局局长如前所述(20)。信言之,经度过RT活性量募化RCAS病毒从细胞培育上清,稀释到终浓度的每200 UL 30000的病毒颗粒,含5%FBS的RPMI布匹局培育基稀释,并贮放于-80 ° C在单壹运用等份。 RCAS病毒不该该被松冻结/松冻结之前,在试验中运用。 RCAS添加以到患者血浆RNA提的效力和稀度的PCR定量把持。不才面的链接: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/却以找到更多关于合会的信息。 “预旋”等退儿子,15毫升锥形退心管中,在2600 XG 15分钟,佩退出产任何脂类和细胞零碎片,它却以烦扰RNA定量正确。 标注签正西顿善于稠密查封的永世性标注识表记标注帜,以决定范本数和颗粒的位置将结合管退心管。前己旋后,让等退儿子到正西顿善于稠密查封的退心管中,演奏的血浆,并备止在外面表上的任何细胞零碎片和/或血脂。记载血浆的输入量。 添加以的Tris缓冲液(TBS),以补养充剩量的正西顿信善查封管螺纹脖儿子底儿子部。确保无气泡,当前在管或管会崩溃的超快退心机。确管的标注识表记标注帜是朝外面管放入转儿子。 稠密查封却重骈运用的瓶盖和壹个预冷Sorval T1270转儿子和Sorval 170000 XG(50,000 RPM)在4 ° C为30分钟90SE超快退心机退心机范本。 退心后摒刊落陈言上清液和添加以90 UL分儿子级的水和10 UL蛋清酶K(20毫克/毫升)病毒颗粒(此雕刻将是不成见的的)。 在55 ° C水浴30分钟孵募化广场管。确管壹边是沉溺在蛋清酶K和水的混合物,使沉淀的角度。 孵募化后不久,在表退心机旋转管,收集儿子所拥有气体的试管底儿子部(条约5秒),并添加以315 UL 6M胍硫氰酸处理方案和10 UL 20毫克/毫升糖原(注:依照适当的此雕刻种拥损害物质的处理绳墨;不运用漂剂或酸混合,放丢丢在孤立的容器 ) 。 涡悄然旋不久(条约5秒)。在室温下孵育10分钟,然后各管的情节传递送到壹个新标注识表记标注帜的1.5毫升核糖核酸酶避免费退心管。 495 UL的分儿子级异丙醇添加以到每个管,退心旋涡10秒,在室温为30分钟,在21000 XG。 丢上清,和70%的乙醇添加以500 UL。 21000 XG用于在室温拙贱5分钟10秒和退心旋涡。取出产用移液管的乙醇。又次旋转和删摒除任何残剩的乙醇用移液器。空气蔫干燥10分钟。 (SGS的协议溶于40 5毫米的Tris - HCl pH值8.0 UL的RNA,并持续与SGS协议)。 55 RNA缓冲UL溶松沉淀。 RNA缓冲是经度过添加以10 UL 100毫米的DTT和25 Rnasin 40 U / UL UL 965 UL的Tris - HCl(pH值8.0,5毫米)。置于冰凌上。 末了尾预备2 1毫升RNA缓冲区中的HIV - 1的RNA和RCAS RNA转录的RNA规范曲线将稀释分装。 RNA缓冲描绘拙贱.13。 预备在2毫升退心管冰凌稀释。参加以的HIV - 1 RNA的股票(1 × 10 6份/ UL)的25到54 UL RNA 缓冲3x10 5份/ UL UL壹半的HIV - 1 RNA的RNA缓冲记载日记稀释。 持续经度过就续的半对数的稀释(25 UL + 54 UL)下投降到0.3份每10 UL(注:0.3,1,3稀释将不会在此雕刻些剖析的规范曲线的壹派断被用干铰断值并应设置为不知数DURING的剖析)。 RCAS效实单的放养稠密度为1 × 10 6份/ UL。异样,预备在RNA缓冲RCAS笔录半日记稀释,但每10 UL下投降到100份。 预备如表1所列的cDNA分松的RT鸡条酒。预备RT和记住,以补养偿壹点额外面的考虑了在传输经过中能突发的任何损违反,如表1所列的尼古丁顶替疗法的反应。注:为尼古丁顶替疗法的鸡条酒,叛逆转录酶是由水所代替,以把持从DNA扩增。

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